Криоконсервация на службе репродуктологии
Криоконсервация тканей, или еще один способ заиметь ребенка. 7748.jpeg

Половые клетки человека сохраняют свои функции после замораживания. Указанное свойство стало основой для развития медицинского направления, цель которого — сохранение репродуктивных функций больных опухолевыми и другими патологиями. На время лечения половые клетки "удаляются" из организма, а после обратно реимплантируются тому же пациенту.

Или в тело другого человека… Поскольку сохранение фертильности мужчин за счет криоконсервации спермы является не столь сложным вопросом и подобная методика в развитых странах уже стала рутинным приемом перед началом гонадотоксичного лечения, то нам представляется более интересным сосредоточиться на все еще крайне трудной проблеме сохранения женской фертильности.

Существуют три опции

Существует три основных опции для сохранения репродуктивной функции таких пациенток: криоконсервация яйцеклеток; их оплодотворение и заморозка эмбрионов; наконец криоконсервация ткани яичников (КТЯ), то есть фрагментов кортикального слоя, изолированных фолликулов или целого яичника. Если половые клетки удается сохранить, но женщина не способна к естественному оплодотворению, то она может воспользоваться вспомогательными

репродуктивными технологиями (ВРТ), например, прибегнуть к ЭКО.

Имеются преимущества КТЯ по сравнению с криоконсервацией яйцеклеток или эмбрионов. Ткань яичника может быть получена без промедления, так как нет необходимости в стимуляции яичников для получения зрелых яйцеклеток. Можно сохранить большое количество гамет (примордиальных фолликулов), и не надо откладывать начало лечения. Наконец, этот метод не требует гормональной терапии, а также применения иммунодепресантов в процессе аутологической трансплантации.

То, что ткань яичника человека может быть успешно заморожена и оттаяна, подтвердили многочисленные эксперименты по оценке восстановлению функций овариальной ткани. Первый же опыт КТЯ человека был осуществлен в 1996 году, причем для криоконсервации был освоен относительно простой и эффективный метод — погружение биологического материала в жидкий азот (витрификация). При витрификации заморозка осуществляется в несколько этапов с инкубацией кусочков ткани в высокой концентрации криопротекторов в течение нескольких минут и последующей быстрой заморозкой. Такой метод позволяет избавиться от формирования разрушающих клетку кристаллов льда. Однако необходимо добиться адекватного проникновения криопротекторов внутрь ткани через строму к яйцеклетке, при этом избежать возможного токсического воздействия. На сегодняшний день существует множество протоколов витрификации. Наилучшие результаты выживания ооцитов (>89%) были получены японскими исследователями [Kagawa et al. 2007, 2009].

В настоящее время основным методом использования замороженной и оттаянной ткани яичника (ТЯ) является аутотрансплантация или реимплантация. Первая разновидность реимплантации фрагментов ТК заключается в ортотопической

(яичник) или гетеротопической трансплантации (под кожу предплечья или брюшной стенки, под капсулу почки). Вторая основана на изоляции фолликулов из ткани яичника и их выращивании in vitro, чтобы избежать обратного переноса возможных опухолевых клеток обратно пациенту. Третья разновидность предполагает заморозку целого яичника с последующей сосудистой трансплантацией, что позволит избежать потери фолликулов из-за ишемии и отсутствия реваскуляризации. Ортотопическая трансплантация ТЯ является на сегодня наиболее разработанным и часто применяемым методом.

Ортотопичекая трансплантация

У человека первая беременность после ортотопической трансплантации КТЯ наступила в 2003 году и закончилась рождением девочки Тамары в 2004 году [Donnez et al., 2004].

В 1997 году у 25-летней пациентки была обнаружена лимфома Ходжкина IV ст. До начала лечения ей было предложено заморозить ТЯ. Лапароскопически была взята биопсия левого яичника размером 1.5×0.5 см и заморожена. Пациентка прошла курс химиотерапии, и в 2003 году 35 фрагментов овариальной ткани были реимплантировали под кортикальный слой атрофированного яичника, когда у пациентки наблюдалась полная аменорея. С 5 по 9 месяц после трансплантации УЗИ ежемесячно показывали развитие доминантного фолликула, также наблюдались менструальные кровотечения. Через 11 месяцев после реимплантации была зафиксирована беременность, завершившаяся рождением здоровой девочки весом 3.720 кг на 39 неделе гестации. Так впервые в мире родился ребенок после ортотопической трансплантации КТЯ.

К сентябрю 2010 г. преимущественно в Европе и Израиле после ортотопической трансплантации у женщин, ранее получивших лечение по поводу различных заболеваний, родились уже 8 девочек и 5 мальчиков. А в 2011г. — еще одна девочка у больной с серповидно клеточной анемией после пересадки кортикального слоя яичника от генетически не родственной сестры. Срок хранения замороженных ТЯ составлял 2-7 лет.

Менструация у женщин-реципиентов начиналась в среднем 4 через месяца после трансплантации и продолжалась 1-4 года. Суммарно было получено сравнимое количество беременностей после пересадки свежей и замороженной ТЯ, но к сожалению, функциональная активность криоконсервированных фрагментов пока оказывается значительно короче. То есть эндокринная функция у большинства женщин после пересадки КТЯ сохранялась не более 1-2 лет. Активность же яичников после трансплантации не замороженной ткани составила около четырех лет. Более 50% женщин после трансплантации КТЯ смогли забеременеть самостоятельно, без использования ВРТ. Это является аргументом в пользу доступности данного метода и возможности его широкого использования в клинической практике.

Гетеротопическая трансплантация

Результаты исследований на животных моделях и у человека показывают, что гетеротопическая трансплантация сопровождается значительно меньшим числом наступления беременностей, по сравнению с ортотопической трансплантацией.

Тем не менее, было описано целых три беременности, полученных после гетеротопической трансплантации КТЯ. Однако овуляция наступила в нативном яичнике, а не в пересаженном фрагменте [Oktay et al. 2006, 2011]. 28-летней пациентке с болезнью Ходжкина через 2,5 года после пересадки костного мозга в нижнюю

часть брюшной стенки была пересажена вдобавок и ранее криокосервированная ТЯ. Через 2 месяца после трансплантации было обнаружено развитие фолликулов. Пациентка забеременела спонтанно 4 раза на протяжении 5 лет и родила троих здоровых детей. Механизм спонтанного восстановления репродуктивной функции с последующей нормальной беременностью после гетеротопической трансплантации яичниковой ткани пока не понятен и должен быть исследован детально.

В то время как ортотопическая трансплантация остается более предпочтительной, так как не нарушает концепции естественного оплодотворения, гетеротопическая трансплантации может быть также правомерна для пациентов после овариэктомии или массивного облучения органов малого таза, а также, если у пациентки затруднен доступ к яичникам или передней брюшной стенке.

Трансплантация целого яичника

Итак, многие ученые, оценивая работу яичника после пересадки свежей или криоконсервированный ТЯ как временную, считают основной причиной угасания функциональной активности яичника ишемию овариальной ткани. Она возникает в первые часы после трансплантации и способна привести к гибели более трети примордиальных фолликулов. Поэтому для восстановления репродуктивного потенциала важно сокращение временного интервала ишемии и ускорение реваскуляризации трансплантатов.

Сосудистая трансплантация была предложена в качестве наиболее логичного подхода по сравнению с трансплантацией кортикального слоя яичников. Несмотря на техническую сложность этой процедуры, она обеспечивает непосредственное кровоснабжение овариальной ткани после пересадки, таким образом, минимизируя опасность

возникновения ишемии. Как было показано на животных, единственным решением этой проблемы является трансплантация целого интактного яичника с микрохирургической пересадкой сосудистых анастомозов. Исследованием и развитием технологии криоконсервации целых органов, так же как и хирургическими методами аутотрансплантации всего яичника с сосудистой ножкой, активно занимаются разные группы учёных. Данный метод лег в основу трансплантации интактных яичников с микрососудистыми анастомозами, выполняющими немедленное восстановление васкуляризации, минимизируя ишемию после трансплантации, и ответственными за восстановление целостности фолликулов. 8 лет назад впервые был описан протокол криоконсервации интактного яичника человека и показана высокая выживаемость фолликулов [Martinez-Madrid et al. 2004]. После процедуры оттаивания ткань имела нормальную гистологическую структуру, функционировали мелкие сосуды, были жизнеспособны клетки стромы.

Успешная аллогенная трансплантация целого яичника была проведена на паре монозиготных близнецов. Одна из сестер имела нормальную функцию яичников и родила двоих детей. У второй же сестры было преждевременное истощение фолликулов. После пересадки ей целого яичника от сестры на 101 день возобновился менструальный цикл, а через 11 регулярных циклов была выявлена спонтанная беременность, в результате которой на 40 неделе гестации родилась здоровая девочка.

Культивирование овариальной ткани и фолликулов in vitro

Хорошо если онкологическое заболевание не дает метастазов в яичник, а что делать, если процесс генерализован и в ТЯ уже есть

опухолевые клетки? В этом случае на помощь приходят технологии культивирования фолликулов in vitro, которые интенсивно разрабатываются в настоящее время

Для изучения фолликулогенеза у животных было предложено множество различных моделей. Однако культивирование единичных примордиальных фолликолов in vitro остается перспективой будущего. А ведь именно из этих фолликулов складывается фолликулярный резерв. Примордиальные фолликулы, как правило, содержат маленький ооцит, находящийся в диплотене первого деления мейоза и окружены единственным слоем уплощенных клеток прегранулёзы и базальной мембраной. Главная задача исследователей — это научиться активировать пул покоящихся примордиальных фолликулов in vitro, а также выявить эндокринные, паракринные и аутокринные факторы, необходимые для роста и созревания первичных фолликулов. Это является ключевым доступом к неограниченному источнику зрелых ооцитов для их биомедицинского использования.

На основании ряда последних исследований была предложена поэтапная многостадийная система развития фолликулов [Smitz et al. 2010]. Сначала культивируют маленькие фрагменты ткани яичника, затем механически выделяют преантральные фолликулы и выращивают их отдельно. Далее из развивающихся антральных фолликулов выделяют кумулюс-ооцит комплексы и культивируют их на специальной мембране или в 3D системе, после чего собранные ооциты подвергают окончательному дозреванию in vitro. Данная система, в теории, позволяет получить зрелый ооцит, однако тонкий подбор ростовых факторов, гормонов и медиаторов необходим на каждом отдельном этапе. Также требуется детальная отработка методов выделения единичных фолликулов и подбор физических параметров культивирования ранних фолликулов. На сегодняшний

день еще не было получено зрелой яйцеклетки человека выращенной in vitro из примордиального фолликула, хотя работы в этом направлении ведутся и имеют определенный успех.

Итак, развитие технологий клеточной трансплантации позволит в будущем перейти от хирургического вмешательства к миниинвазивным операциям, что приведет к широкому внедрению данного метода реимплантации фолликулов в клиническую практику.

Рылов Александр
Семь признаков старения, которые не исправить косметологам Семь признаков старения, которые не исправить косметологам Что новенького?
Старость - это не только морщины. Самое главное - помнить, что возраст внутри, а не снаружи, и быть благородной старушкой лучше, чем пожилой девочкой.
Зачать ребенка поможет "хвост" Зачать ребенка поможет "хвост" Репродуктология
Ученые из Браунского университета шагнули дальше Всемирной организации здравоохранения в оценке способности к оплодотворению.